Рис. 1. Брюшко медоносной пчелы Apis mellifera c присосавшимся клещом Varroa destructor на обложке свежего выпуска журнала Science. Фото © Alexander Wild
Медоносные пчелы по всему миру страдают от паразитических клещей Varroa destructor, которые не только ослабляют насекомых, высасывая из них гемолимфу и жировую ткань, но и заражают опасным вирусом деформации крыльев (DWV). Американские ученые показали, что и с клещом, и с вирусом можно бороться при помощи бактерий Snodgrassella alvi, обитающих в пчелином кишечнике. Этих бактерий удалось генетически модифицировать таким образом, чтобы они производили двухцепочечную РНК, соответствующую участкам генома либо вируса, либо клеща. В первом случае двухцепочечная РНК, попадая из кишечника пчелы в ее ткани и органы, запускает механизм РНК-интерференции, помогающий пчеле справиться с вирусной инфекцией. Во втором случае тот же механизм отключает в клетках клеща жизненно важные гены, фактически заставляя клеща самоуничтожиться.
Медоносную пчелу (Apis mellifera) мы ценим не только как производителя мёда и других продуктов пчеловодства, но и как эффективного опылителя культурных растений и удобный модельный объект разнообразных биологических исследований.
Пчелы — нежные создания. Характерная для пчел высокоразвитая социальность, при всех ее преимуществах, имеет и оборотную сторону: жизнь в больших сплоченных коллективах повышает уязвимость насекомых к некоторым паразитам и инфекциям. Серьезный ущерб пчеловодству приносят распространившиеся по всему миру паразитические клещи Varroa destructor (рис. 1 и 2). Они не только ослабляют насекомых, питаясь тканями взрослых особей, личинок и особенно куколок, но и способствуют распространению опаснейшего вируса DWV (Deformed wing virus, вирус деформации крыльев).
Рис. 2. Клещи Varroa destructor на спинке медоносной пчелы. Когда пчела ползает внутри улья, клещи могут переползать на других пчел или на личинок. Фото с сайта geneticliteracyproject.org
Недавно специалисты начали разрабатывать новый перспективный подход к защите пчел от подобных напастей, основанный на использовании механизма РНК-интерференции (RNA interference). Этот механизм имеется у многих эукариот (см.: Дрожжи отказались от противовирусной защиты, чтобы приютить вируса-убийцу, «Элементы», 22.09.2011). Его исходной функцией, по-видимому, является защита от РНК-вирусов. Триггером для запуска механизма РНК-интерференции служит появление в клетке двухцепочечной РНК (dsRNA). Когда это происходит, система РНК-интерференции начинает уничтожать все РНК с такой же последовательностью нуклеотидов (в том числе и обычные, одноцепочечные).
РНК-интерференция лежит в основе широко используемой в экспериментальной биологии методики подавления экспрессии генов (Gene knockdown). В организм вводят dsRNA с нуклеотидной последовательностью, совпадающей с участком гена, который ученые хотят отключить. Тем самым активируется система РНК-интерференции, которая начинает исправно уничтожать матричные РНК, считанные с данного гена. В результате белок, кодируемый геном, перестает синтезироваться.
Ранее уже было показано, что при помощи РНК-интерференции в принципе можно помочь пчелам справляться как с вирусами (включая DWV), так и с эукариотическими паразитами (включая клещей). В первом случае используется dsRNA с последовательностью, совпадающей с участком вирусного генома. Когда такая РНК попадает в клетки пчелы, пчелиная система РНК-интерференции начинает эффективно уничтожать вирусные РНК. Во втором случае последовательность dsRNA должна совпадать с участком какого-нибудь жизненно важного гена клеща (или, для верности, сразу с несколькими участками нескольких важных генов). Когда такая dsRNA попадает в клеща, тот фактически совершает самоубийство: его собственная система РНК-интерференции по команде послушно отключает необходимые для жизни клеща гены.
Но как доставить dsRNA в клетки пчел и клещей? Понятно, что делать им индивидуальные инъекции не очень практично. Хорошая новость состоит в том, что, как выяснилось, никаких инъекций для этого не нужно: достаточно просто подмешать РНК пчелам в корм (S. D. Desai et al., 2012. Reduction in deformed wing virus infection in larval and adult honey bees (Apis mellifera L.) by double‐stranded RNA ingestion). Двухцепочечные РНК благополучно проникают из пищеварительного тракта пчелы не только в клетки самой пчелы, но и в клетки клеща, который пожирает ее гемолимфу и жировое тело. Может показаться странным, что, имея изощренную систему РНК-интерференции для борьбы с dsRNA внутри клеток, эти животные не удосужились обзавестись нормальными ферментами для уничтожения dsRNA в пищеварительном тракте. Но таковы факты: dsRNA из кишечника пчелы как-то добирается до тканей и органов как пчелы, так и клеща.
Но есть и плохая новость, состоящая в том, что синтез двухцепочечных РНК — удовольствие не из дешевых, и к тому же эти РНК в природных условиях быстро разрушаются. Поэтому защищать пчел, подкармливая их специально синтезированными dsRNA — идея, может быть, и красивая, но тоже не очень практичная.
Статья американских биологов, опубликованная 31 января в журнале Science, сообщает об изящном решении этой проблемы. Авторы сумели поместить внутрь пчелы настоящую живую фабрику по производству dsRNA с заданной последовательностью нуклеотидов.
В роли фабрики выступает симбиотическая бактерия Snodgrassella alvi — типичный обитатель пчелиного кишечника. В бактерию внедряется плазмида, обеспечивающая производство dsRNA. Для этого участок плазмидной ДНК с нужной (например, вирусной) последовательностью нуклеотидов помещается между двумя промоторами, расположенными на разных нитях ДНК. Эти промоторы обеспечивают «встречную» транскрипцию сразу обеих комплементарных нитей ДНК на участке между промоторами. В итоге получаются две одноцепочечные РНК, комплементарные друг другу, которые сами сворачиваются в двухцепочечную РНК. Использование модифицированных симбиотических бактерий для производства и доставки dsRNA в клетки хозяина ранее уже было апробировано на других насекомых — клопах Rhodnius prolixus, переносчиках болезни Шагаса, и западных цветочных трипсах, опасных вредителях культурных растений (M. M. A. Whitten et al., 2016. Symbiont-mediated RNA interference in insects)
Для начала авторы убедились, что генно-модифицированные бактерии S. alvi жизнеспособны и успешно приживаются в кишечнике пчел (насекомых предварительно кормили антибиотиком, чтобы удалить конкурирующую микрофлору). Дальнейшие эксперименты показали, что производимые бактериями dsRNA успешно распространяются, попадая в самые разные ткани и органы пчелы, и что это приводит к активации пчелиных генов, участвующих в иммунном ответе на dsRNA, в том числе и генов системы РНК-интерференции. На этом этапе использовались бактерии, производящие dsRNA с последовательностью нуклеотидов, не совпадающей ни с какими пчелиными генами.
Затем ученые проверили, можно ли таким способом подавить экспрессию какого-нибудь гена пчелы. Для этого эксперимента выбрали ген InR1, кодирующий инсулиновый рецептор. Пчелам в кишечник поселили бактерий S. alvi, производящих dsRNA, соответствующую участку этого гена. В результате у пчел действительно понизилась экспрессия InR1. У пчел ожидаемым результатом ослабления функции инсулинового рецептора является активизация пищевого поведения и ускоренный набор веса. Именно это и произошло: пчелы с генно-модифицированными бактериями в кишечнике заметно растолстели по сравнению с контрольными пчелами.
В следующем эксперименте было проверено, могут ли ГМ-бактерии защитить пчелу от вируса DWV (рис. 3). Сначала пчел заражали бактериями, которые либо не производили никаких dsRNA (Plasmid pNR на рис. 3), либо синтезировали dsRNA с последовательностью гена зеленого флуоресцирующего белка (pDS-GFP), либо продуктом жизнедеятельности бактерий была dsRNA с вирусной последовательностью (pDS-DWV2). Затем пчелам делали инъекцию вируса DWV (Injection DWV на рис. 3), а в качестве контроля использовали инъекцию физраствора (PBS).
Рис. 3. Генно-модифицированные бактерии защищают пчел от вируса DWV. A — схема плазмиды, которую внедряли в бактерий S. alvi перед тем, как заразить бактериями пчел. Схема показывает, что в плазмиде присутствует кусочек вирусного генома (DWV genome), заключенный между двумя промоторами (стрелки), что обеспечивает производство dsRNA. B — выживаемость пчел после инъекции вируса (сплошные линии) или физраствора (пунктирные линии). По горизонтальной оси — время в сутках после инъекции, по вертикальной — процент живых пчел. Видно, что наименьший ущерб вирус причинил пчелам, у которых в кишечнике жили бактерии с плазмидой, производящей dsRNA с вирусной последовательностью (сплошная сиреневая линия проходит выше, чем серая и желтая). Остальные пояснения в тексте. Рисунок из обсуждаемой статьи в Science
Эксперимент показал, что бактерии с плазмидой pDS-DWV2 значимо повышают выживаемость зараженных вирусом пчел по сравнению с двумя другими вариантами ГМ-бактерий.
В заключительном эксперименте проверялась возможность борьбы с клещами Varroa при помощи сидящих в кишечнике пчелы генно-модифицированных бактерий, производящих dsRNA с последовательностью, соответствующей кусочкам 14 жизненно важных генов клеща (плазмида pDS-VAR). Пчел заражали ГМ-бактериями, а спустя пять суток на пчел сажали клещей. Выяснилось, что смертность клещей резко повышается, если в кишечнике пчелы живут бактерии с плазмидой pDS-VAR (рис. 4).
Рис. 4. Генно-модифицированные бактерии с плазмидой pDS-VAR (производящие dsRNA с фрагментами последовательностей 14 генов клеща) значимо повышают смертность клещей Varroa, паразитирующих на пчелах. График показывает выживаемость клещей, обозначения как рис. 3. Рисунок из обсуждаемой статьи в Science
Генно-модифицированные бактерии успешно передаются от пчелы к пчеле в лаборатории, но еще предстоит проверить, насколько такая передача будет эффективна в больших ульях. Авторы подчеркивают, что до практического применения метода еще далеко. Есть надежда, что эффективность метода можно сильно повысить — например, подавив у бактерий активность рибонуклеазы III (ribonuclease III). Кроме того, необходима тщательная проверка на безопасность. В конце концов, должны же мы быть уверены, что генно-модифицированные бактерии или их плазмиды, смертельные для вирусов и клещей, не разбегутся повсюду, эволюционируя, перепрыгивая на другие виды и вызывая непредсказуемые изменения в экосистемах.
Источник: elementy.ru
